Le jeu commence lorsque Ezio se bat dans la rue contre ses ennemis jurés, les Pazzi.

Noble de Florence, ami de Leonardo Da Vinci, il devient un Assassin pour venger la mort de son père et de ses deux frères, pendus sur une place publique et victimes d'un complot d'autres familles puissantes Templieres .

Ezio découvre alors l'instrument de ce complot : Uberto Alberti, puis l'assassine avant de s'exiler avec sa mère et sa soeur en sécurité dans le village de son oncle : Monteriggioni.

Après cela, Ezio assassine tous les autres Templiers qui ont comploté contre sa famille. Sa dernière cible n'est autre que Rodrigo Borgia, le futur pape, qui tente de s'emparer de l'Orbe d'Eden . Après plusieurs combats, Ezio parvient à ses fins et a récupérer la pomme et le baton, mais épargne son ennemi. Ensuite, il entre dans le sanctuaire et rencontre Minerve, qui fait part de ses craintes envers la civilisation du XXIe siècle. Pendant ce temps, Rodrigo prend la fuite...

Afin d'éradiquer la corruption et restaurer son honneur familial, il étudiera également les secrets du Codex d'Altaïr avec l'aide de Leonardo Da Vinci.