En janvier 1500, Ezio et son oncle rejoignent leur résidence de Monteriggioni. Ezio s'apprête à prendre du repos et raconte donc ce qu'il a vu à Rome à Mario, sa mère Maria, sa sœur Claudia, Machiavelli et Caterina Sforza. Le lendemain, la ville est prise d'assaut par les forces de Cesare Borgia, qui tue Mario et vole la Pomme. Ezio tente de défendre la ville le temps que les habitants fuient, mais il est blessé. Malgré cela, il part rejoindre Machiavelli à Rome.

Ezio, sauvé par une mystérieuse femme et amené à Rome, rejoint Machiavelli, qui lui explique dans quelle situation se trouve la cité, totalement sous le contrôle des Borgia. Il enfile à nouveau sa tenue d'Assassin pour affronter les forces armées de Cesare. 

Avec l'aide de ses alliés Assassins venus à Rome pour combattre, Ezio forme une armée de résistants au régime militaire des Borgia, en les initiant aux rites des Assassins. Il retrouve également Léonardo Da Vinci, contraint par Cesare de construire des armes modernes qu'Ezio doit détruire pour affaiblir l'influence des Borgia et permettre la reconstruction de la ville. Grâce à leur aide, il parvient à tuer les alliés les plus puissants de Cesare Borgia, qui a comme seule option finale d'utiliser la Pomme d'Eden. Au Château Saint-Ange, Ezio surprend une violente dispute entre Cesare et son père, Rodrigo Borgia, ce dernier ayant dissimulé la Pomme. Cesare le tue en lui enfonçant une pomme empoisonnée dans la bouche, après qu'il l'a lui-même croqué. Ezio apprend de Lucrezia la cachette de la Pomme, s'en empare et, grâce à elle, parvient à disperser les dernières forces de Cesare, qui est finalement arrêté en 1503.

Ezio voit cependant une partie de son avenir à travers la Pomme. Il reprend la route, et retrouve Cesare en 1507, dans la ville de Viana en Espagne, mise à feu et à sang. Ezio poursuit Cesare et l'affronte sur les murailles d'une citadelle. Il gagne le duel, mais Cesare refuse de mourir de la lame secrète de l'Assassin, qui le précipite donc du haut des murs.