Ezio : Né d'une riche famille de Florence, il devient un assassin a la mort de son père et de ses deux frères. Il cherche a venger sa famille de tous les Templiers qui ont comploté contre elle. Il découvrira aussi avec l'aide de Machiavelli qu'il est le Prophète.

 

Rodrigo Borgia : Grand Maître des Templiers, c'est lui qui a comploté contre la famille d'Ezio. Il est l'homme que l'Assassin traque. Après avoir était vaicus par Ezio près du Sanctuaire, il s'enfuit à Rome pour achever ses plans.

Uberto Alberti : Avant de trahir les Auditore, il était un ami proche du père d'Ezio. Il était un homme politique puissant qui se rangea aux côtés des Templiers. Il fut la première victime d'Ezio qui l'assassina pendant une exposition, devant une centaine de personne.

Les Pazzi: Ennemi des Auditore, ils étaient un groupe familliale vivant à Florence. Faisant parti des Templiers, ils furent impliqués dans la tentive de meutre sur les Medici.