Ezio Auditore, maintenant âgé de 52 ans et au terme de sa quête d'Assassin recherche les secrets du grand maître assassin Altaïr Ibn La-Ahad se situant dans la bibliothèque de la forteresse de Masyaf. Il y découvre l'entrée d'une pièce secrète mais surtout un groupe de soldats Templiers, qui opère dans cette région sous couvert mais cherchant eux aussi les clés. Ezio apprend que les autres clés se trouvent à Constantinople où elles ont été cachées par Niccolo Polo. Les emplacements des clés sont encodés dans des textes, eux-mêmes dissimulés dans les monuments de la ville, et afin de déchiffrer les écrits du voyageur, Ezio fait appel à Sofia Sartor, une libraire italienne

Ezio doit également reprendre Constantinople tombée aux mains des Byzantins avec l'aide de Yusuf Tazim, le chef local des Assassins. Ils se retrouvent ainsi impliqués dans le conflit entre le Prince Ahmet et son frère Selim, tous deux désireux de s'emparer du sultanat. Ezio y fait aussi la connaissance d'un jeune étudiant, Suleiman, qui soupçonne un complot des Byzantins.

De retour à Constantinople Ezio part défier Ahmet, qui a tué Yusuf et pris Sofia en otage. Après un assaut sur l'arsenal de la ville, Ezio et Ahmet conviennent d'un échange : les clés de Masyaf contre la vie de Sofia. Ezio est donc contraint de donner les clefs à Ahmet. Ezio le poursuit, et ils entament une course de diligence, qui se termine par l'arrivée du nouveau sultan Selim qui s'empresse de précipiter du haut d'une falaise son propre frère. Selim ordonne ensuite à Ezio de quitter la ville avec Sofia et de ne plus revenir, laissant la vie sauve à un homme que Suleiman (le fils de Selim) tient en grande estime.

Ouvrant la bibliothèque d'Altäir, Ezio se trouve face à une nouvelle Pomme, qu'il décide de la laisser dans le sanctuaire et a enfin sa révélation.